Zoonotiskt simianskummigt virus i Bangladesh återspeglar olika mönster för överföring och saminfektion

Fullständig artikel Figurer och data Referenser Citat Metrics Licensing Reprints & Permissions PDF SammanfattningSimian foamy virus (SFVs) är allestädes närvarande i icke-mänskliga primater (NHPs). Som med alla retrovirus leder omvänd transkription av SFV till rekombination och mutation. Eftersom det har visat sig att fler människor är infekterade med SFV än med något annat simianburet virus är SFV en potentiellt kraftfull modell för att studera virologi och epidemiologi av virus vid gränssnittet mellan människa och NHP. I Asien överförs SFV sannolikt till människor genom makakbett och repor som uppstår i vardagslivet. Vi analyserade flera provirala sekvenser från SFV -gaggenen från både människor och makaker för att karakterisera retroviral överföring vid human/NHP -gränssnittet i Bangladesh. Här rapporterar vi bevis för att människor kan infekteras samtidigt med flera SFV-stammar, med vissa individer infekterade av både en autokton SFV-stam såväl som en stam som liknar SFV som finns i makaker från ett annat geografiskt område. Dessa data, i kombination med tidigare resultat, tyder på att både förenklad förflyttning av makaker som leder till införandet av icke-bosatta stammar av SFV och retroviral rekombination i makaker bidrar till SFV-mångfald bland människor i Bangladesh. överföring Inledning Skumvirus (FV) är en underfamilj av retrovirus som är utbredda i ryggradsdjur, inklusive icke-mänskliga primater, katter, kor och hästar.1 Meiering CD, Linial ML.Historiskt perspektiv av skummande virusepidemiologi och infektion. Clin Microbiol Rev2001;14:165–176. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] FV är gamla exogena virus som effektivt överförs mellan värdar men inte är kända för att orsaka sjukdom.2 Switzer WM, Salemi M, Shanmugam Vet al. skummande virus och primater. Nature2005; 434: 376–380. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Även om det är nästan allestädes närvarande i icke-mänskliga primater (NHP), är simian foamy virus (SFV) inte endemiskt hos Homo sapiens. Zoonotisk infektion av människor med SFV har tidigare upptäckts i flera länder och i olika sammanhang av kontakt mellan arter, inklusive NHP-laboratorier och djurparksarbetare i Nordamerika, arbetare i 'aptemplet', husdjursägare och människor som lever runt frigående makaker i syd och sydost Asien och bushmeat jägare i Centralafrika.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 och simian foamy retroviruses in humans: discovery, epidemiology, cross-species transmission and molecular virology. Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar] Hittills har NHP-till-människa-överföring av SFV dokumenterats hos> 100 personer, mycket mer än antalet överföringshändelser mellan olika arter för de andra kända NHP-burna retrovirusen: simian immunbristvirus , simian retrovirus D eller simian T-cell lymfotrofiskt virus.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 och simian skummande retrovirus hos människor: upptäckt, epidemiologi, artöverföring och molekylär virologi . Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar],4Khabbaz RF, Heneine W, George JRet al. Infection of a laboratory worker with simian immunodeficiency virus. N Engl J Med1994;330:172–177. [Crossref], [Google Scholar],5Lerche NW, Switzer WM, Yee JLet al. Bevis på infektion med aptyp D retrovirus hos personer som yrkesmässigt exponeras för icke-mänskliga primater. J Virol2001; 75: 1783–1789. [Crossref], [Google Scholar],6Switzer WM, Bhullar V, Shanmugam Vet al. Frequent simian foamy virusinfektion hos personer som yrkesmässigt exponeras för icke-mänskliga primater. J Virol2004; 78: 2780–2789. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar], 7Kalish ML, Wolfe ND, Ndongmo CB et al. Centralafrikanska jägare utsatta för simian immunbristvirus. Emerg Infect Dis2005;11:1928–1930. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Med tanke på den höga förekomsten av SFV i NHP och mångfalden och omfattningen av gränssnittet mellan människor och NHP, uppskattas det att globalt sett kan antalet infekterade individer nå tiotals av tusentals.8Engel G, Hungerford LL, Jones-Engel Let al. Riskbedömning: en modell för att förutsäga överföring mellan arter av apskumsvirus från makaker (M. fascicularis) till människor vid ett aptempel i Bali, Indonesien. Am J Primatol2006; 68: 934–948. [Crossref], [Google Scholar],9Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al. Nya simian foamy virusinfektioner från flera aparter hos kvinnor från Demokratiska republiken Kongo. Retrovirology2012;9:100. [Crossref], [Google Scholar] Dessutom tyder de få longitudinella studierna av SFV-infekterade människor på att SFV inte överförs från en person till en annan.10Boneva RS, Switzer WM, Spira TJet al.Klinisk och virologisk karakterisering av ihållande mänsklig infektion med simian skummande virus. AIDS Res Hum Retroviruses2007; 23: 1330–1337. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Som sådan kan karakterisering av de faktorer som påverkar zoonotisk överföring av SFV ge den bästa samtida modellen för att förstå hur och varför vissa NHP-virus kan orsaka ihållande människo- till Vår grupp har studerat gränssnittet mellan människor och NHP i Bangladesh under de senaste 6 åren, med fokus på överföring av smittämnen mellan arter.11 Oberste MS, Feeroz MM, Maher Ket et al. i Bangladesh, 2007–2008. J Virol2013; 87: 558–571. [Crossref], [Google Scholar], 12Oberste MS, Feeroz MM, Maher Ket al.Naturligt förvärvade picornavirusinfektioner i omänskliga primater vid Dhaka Zoo. J Virol2013; 87: 572–580. [Crossref], [Google Scholar],13Karlsson EA, Engel GA, Feeroz MMet al. Influenza virus infection in nonhuman primates. Emerg Infect Dis2012;18:1672–1675. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Bangladesh är ett av världens mest tätbefolkade länder, med många stadsområden belägna inom eller nära NHP-habitat. Flera NHP taxa är infödda i Bangladesh, med rhesus macaque (Macaca mulatta) den mest talrika och mest spridda.14 Hasan K, Aziz MA, Alam SMet al. Fördelning av rhesus macaques (Macaca mulatta) i Bangladesh: variation mellan befolkningen i grupp storlek och sammansättning. Primate Conserv2013; 26: 115–124. [Crossref], [Google Scholar] När skogens livsmiljö fortsätter att minska, trivs de små, ekologiskt flexibla rhesusna i människoförändrade livsmiljöer, särskilt i områden där kulturella attityder uppmuntrar deras tolerans.15 Feeroz MM, Soliven K, Small CT et al. Befolkningsdynamik av rhesus -makaker och tillhörande skummande virus i Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Även om kontakt mellan människor och rhesusmakaker förekommer främst i samhällen där makakerna är frigående, förekommer den också vid religiösa helgedomar som har blivit tillflyktsorter för makaker och genom husdjursägande av makaker. Dessutom har ett nomadiskt folk, på olika sätt känt som Bade, eller Qalandar, reste i regionen i århundraden och försörjt sig genom att arrangera föreställningar med utbildade makaker. Till skillnad från Afrika är jakt på apor för bushmeat sällsynt i Bangladesh, eftersom den är begränsad till ursprungsbefolkningar i Chittagong Hill Tracts-områdena som gränsar till Myanmar.16Chowdhury MSH, Halim M, Miah Met al. Forskningskommunikation: användning av biologisk mångfald genom att skörda faunaresurser från skogar av Mro-stammen i Chittagong Hill Tracts, Bangladesh. Int J Biodiversity Sci Manage2007; 3: 56–62. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] NHP-till-människa-överföring av SFV tros ske vanligast genom bett. SFV replikerar aktivt i munslemhinnan hos infekterade apor, och uppnår höga koncentrationer i saliv, där genomiska och mRNA lätt kan detekteras.17Murray SM, Picker LJ, Axthelm MK, Linial ML.Utökade vävnadsmål för replikering av skumvirus med simian-immunbristvirus inducerad immunsuppression. J Virol2006; 80: 663–670. [Crossref], [Google Scholar] Men relativt lite är känt om hur värd- eller virala egenskaper påverkar SFV -överföring. Även allvarliga bett resulterar inte tillförlitligt i infektion.9Switzer WM, Shaohua T, Ahuka-Mundeke Set al. Nya simian foamy virusinfektioner från flera aparter hos kvinnor från Demokratiska republiken Kongo. Retrovirology2012;9:100. ] Till exempel, medan proviralt DNA detekteras ihållande under årtionden hos vissa SFV-infekterade människor; andra individer utvecklar antikroppar mot SFV utan detekterbart proviralt DNA.3Gessain A, Rua R, Betsem E, Turpin J, Mahieux R.HTLV-3/4 och simian foamy retrovirus hos människor: upptäckt, epidemiologi, överföring mellan arter och molekylär virologi. Virology2013; 435: 187–199. [Crossref], [Google Scholar] Det återstår att upptäcka om vissa individer rensar infektion, eller om vissa virusstammar är mer kapabla att hålla ut. Ytterligare forskning behövs för att fastställa om det, analogt med SIV/HIV, där rekombination mellan retrovirala stammar i en ny värd var en föregångare till utvecklingen av pandemiska virus, finns bevis för att SFV rekombinerar i mänskliga värdar. Få studier har genomförts för att avgöra om koncentrationen av SFV i saliv påverkar zoonotisk överföring eller hur det mänskliga immunsvaret underlättar eller förhindrar infektion eller fortsatt viremi (Soliven et al. och Matsen et al., opublicerad). Och även om data som samlats in i andra geografiska områden och andra sammanhang av kontakt mellan människa och makak har gett insikt i hur demografiska variabler och makak och mänskligt beteende bidrar till sannolikheten för makak-på-mänsklig aggression, är relativt lite känt om hur dessa variabler påverkar retroviral sjukdom. transmission.18Fuentes A, Gamerl S. Oproportionerligt deltagande efter ålder/kön klasser i aggressiva interaktioner mellan långsvansade makaker (Macaca fascicularis) och mänskliga turister i Padangtegal monkey forest, Bali, Indonesien. Am J Primatol2005; 66: 197–204. [Crossref], [Google Scholar] Här presenterar vi data som beskriver mänskliga exponeringar för rhesusmakor och infektion med SFV på flera platser i Bangladesh och hos aporägare. De flesta andra studier har fokuserat på en region av pol-genen (integras), som är mycket konserverad och därför kanske inte avslöjar SFV-variation som finns hos infekterade individer av en art. Vi har fått flera kloner från helblod och sekvenserat en del av SFV -gaggenen, valt över pol för att avslöja större SFV -genetisk variation och använt sekvensdata för jämförelse av viruset som finns hos människor med det som finns i makaker med vilka de interagerar . Vi visar att människor kan infekteras samtidigt av flera SFV-stammar; vissa individer infekteras av både en autokton (med ursprung där den finns) såväl som en stam som liknar SFV som finns i makaker från andra geografiska områden. Ökande ålder var en signifikant riskfaktor för zoonotisk överföring av SFV hos människor. Kvinnligt kön och hinduistisk religion kan också vara förknippade med ökad risk. Dessa data kombinerade med våra tidigare resultat15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.Population dynamics of rhesus macaques and associated foamy virus in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] föreslår att mänskligt underlättad förflyttning av makaker, multipla SFV-infektioner och retroviral rekombination alla bidrar till retroviral mångfald i Bangladesh. MATERIAL OCH METODERStudieplatser och populationer Studiepopulationen inkluderade 209 mänskliga försökspersoner provtagna i fem samhällen platser (Sylhet, Bormi, Dhamrai, Narayanganj och Charmaguria), samt 13 utförande apaägare som tillhör en nomadgrupp som framför uppträdanden med sina utbildade makaker. Samhällsplatserna etablerades 2007 på platser där makaker sträcker sig fritt och där invånarna var villiga att delta i longitudinell forskning om överföring av smittämnen mellan arter. Vi provade de utförande apaägarna opportunistiskt när vi stötte på dem på väg till eller från våra samhällsstudier. En analys av SFV-diversiteten bland apor från Bangladesh presenteras i vår följestudie.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Populationsdynamik hos rhesusmakaker och tillhörande skumvirus i Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Data från den studien utgör också en del av den macaque SFV-datauppsättning som undersöks i den aktuella studien. Här presenterar vi en kort beskrivning av fältplatserna (Figur 1) som ingår i denna studie. Zoonotiskt simianskumvirus i Bangladesh speglar olika överföringsmönster och saminfektion Alla författare Gregory A Engel, Christopher T Small, Khanh Soliven, Mostafa M Feeroz, Xiaoxing Wang, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L Jackson, Frederick A Matsen IV, Maxine L Linial & Lisa Jones-Engel https://doi.org/10.1038/emi.2013.60Publicerad online: 25 januari 2019 Figur 1 Provtagningsplatser och mångfald av SFV-stammar som detekterats hos zoonotiskt infekterade människor. Mänskliga försökspersoner intervjuades och provtogs på fem urbana platser i Bangladesh där rhesusmakaker var frigående. Vi har nyligen visat att på var och en av dessa platser kan en eller flera kärnstammar av SFV detekteras i macaques.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.Population dynamics of rhesus macaques and associated foamy virus in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Rhesus SFV-kärnstammarna är färgkodade på denna karta. För mänskliga försökspersoner (betecknade med "BGH") som visade sig vara infekterade med SFV, erhöll vi flera kloner från helblod och sekvenserade en del av SFV-gag-genen. Sekvensdata användes för att jämföra viruset som finns hos människor med det som finns i makaker från den platsen. Färgen på cirkeln/cirklarna bredvid var och en av BGH-identifierarna anger SFV-stammen som detekterades hos dessa människor. Observera att fyra av försökspersonerna samtidigt infekterades av flera SFV -stammar och att vissa individer är infekterade av både en autokton (med ursprung där den hittades) SFV -stam samt en stam som liknar SFV som finns i makaker från andra geografiska områden. nks, ingen känd källa. Visa full storlek Figur 1 Provtagningsplatser och mångfald av SFV -stammar som detekterats hos zoonotiskt infekterade människor. Mänskliga försökspersoner intervjuades och provtogs på fem urbana platser i Bangladesh där rhesusmakaker var frigående. Vi har nyligen visat att på var och en av dessa platser kan en eller flera kärnstammar av SFV detekteras i macaques.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.Population dynamics of rhesus macaques and associated foamy virus in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] Rhesus SFV-kärnstammarna är färgkodade på denna karta. För mänskliga försökspersoner (betecknade med "BGH") som visade sig vara infekterade med SFV, erhöll vi flera kloner från helblod och sekvenserade en del av SFV-gag-genen. Sekvensdata användes för att jämföra viruset som finns hos människor med det som finns i makaker från den platsen. Färgen på cirkeln/cirklarna bredvid var och en av BGH-identifierarna anger SFV-stammen som detekterades hos dessa människor. Observera att fyra av försökspersonerna samtidigt infekterades av flera SFV -stammar och att vissa individer är infekterade av både en autokton (med ursprung där den hittades) SFV -stam samt en stam som liknar SFV som finns i makaker från andra geografiska områden. nks, ingen känd källa. SylhetBeläget i den nordöstra delen av landet, inom 35 km från gränsen till Indiens Assam -provins, är Sylhet den tredje största staden i Bangladesh. En befolkning på cirka 125 makaker finns vid Shah Jalal -helgedomen i stadens centrum. Sylhets makaker sträcker sig över helgedomsplatsen och in i det omedelbart intilliggande området. Shah Jalals makaker tillhandahålls regelbundet av helgedomspersonalen och får ofta mat från besökare till helgedomen. Fjorton mänskliga försökspersoner som bor nära helgedomen deltog i studien. Bormi I staden Bormi, cirka 50 km norr om Dhaka, sträcker sig mer än 200 rhesus -makaker i hela byn, rör sig fritt mellan hinduiska och muslimska områden, ofta in i hem för att söka av mat. Även om en del Bormibor ibland erbjuder mat till makakerna, finns det ingen organiserad proviantering. Totalt 105 människor från Bormi deltog i denna studie. Dhamrai Staden Dhamrai ligger 40 km sydväst om Bormi. Cirka 75–100 makaker sträcker sig fritt genom Dhamrai. Makakerna gynnar områden med stor skugga och fruktträd, som är vanligare i hinduiska kvarter. Liksom i Bormi finns det ingen organiserad proviantering av makaker. Nio försökspersoner från Dhamrai ingick i denna dataset. Narayanganj Narayanganj är en tätbefolkad hamnstad cirka 20 km söder om Dhaka. Rhesus macaque -befolkningen fortsätter att minska i detta område när stadsutvecklingen förskjuter grönområden. De uppskattningsvis 60 makakerna i den här staden tillhandahålls inte och är inte väl vana vid människor. Trettiosex försökspersoner från Narayanganj deltog i studien.CharmaguriaCharmaguria ligger 150 km söder/sydväst om Dhaka längs Padmafloden. De >200 makakerna i detta område tillhandahålls av en lokal organisation på en central plats, och rikliga grönområden i denna lilla stad ger naturliga korridorer längs vilka djuren sträcker sig brett. Fyrtiofem försökspersoner från Charmaguria deltog i studien. Rekrytering, informerat samtycke och provtagningsprotokoll, inklusive uppföljning av SFV-positiva individer, har godkänts av University of Washingtons Human Subjects Review Board (23055) och en analog granskningsnämnd på Jahangirnagar University, Bangladesh. Biologiska och demografiska data från mänskliga försökspersoner kodades med unika, anonyma identifierare som började med 'BanGladesh Human' (BGH). På varje samhällsplats inledde Bangladeshiska gruppmedlemmar kontakt med grannskapsledare och identifierade en central plats inom makakernas intervall för datainsamling. Bangladeshiska teammedlemmar samarbetade sedan med invånare i samhället och fläktade ut till fots och bad om deltagande av personer som identifierade sig själva som blivit bitna eller skadade av makaker. Inkluderingskriterier för försökspersonerna inkluderade ålder över 18 år, självrapporterad exponering för NHP och/eller långtidsboende (> 20 år) i byn. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla ämnen. Demografiska data och data som beskriver NHP-exponeringar erhölls genom ett frågeformulär som administrerades av en gruppmedlem på det lokala språket, bengali. Tio milliliter helblod samlades upp från varje försökspersons antecubitalven i ett rör innehållande etylendiamintetraättiksyra, lagrades på is i högst 12 timmar och centrifugerades sedan. Helblod och plasmaprover lagrades vid -80 ° C tills de analyserades. Whatman Sterile Omni Swabs (Whatman, Piscataway, NJ, USA) användes för att förvärva buccal mucosal prover. Svabbar placerades omedelbart i 500 µL Qiagen Buffer RLT (Qiagen, Valencia, CA, USA) kyld på is i högst 12 timmar innan de frystes vid -80 °C tills de analyserades. Dessa metoder är i huvudsak identiska med de vi använde för att förvärva och lagra biologiska prover från makaker.15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Populationsdynamik hos rhesusmakaker och tillhörande skummande virus i Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar]Upprepad provtagning av bekräftade SFV-positiva människor Om en människa bekräftades SFV-positiv genom polymeraskedjereaktion (PCR), försökte forskargruppen att kontakta och ta om provet cirka 1 år efter den första provtagningen . De biologiska provtagningsprotokollen för uppföljande provtagning av de SFV-positiva försökspersonerna var desamma som användes under den initiala provtagningen. Dessutom fick SFV-positiva ämnen en kort fysisk undersökning och en fördjupad medicinsk historia samlades in. Rhesus makakprovtagning Vårt följeslagna manuskript för detta projekt 15 Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] tillhandahåller alla djurprovtagnings- och laboratorieprotokoll. SFV -gag -sekvenser från totalt 184 rhesus -makaker ingår i föreliggande studie (figur 2). Vi inkluderar också i denna dataset sekvenser som erhållits från fyra rhesus, två från Dhamrai och två från Bormi, som vi kunde prova om två år efter deras första provtagning. Zoonotiskt simian foamy virus i Bangladesh återspeglar olika mönster av överföring och samtidig infektion. Alla författare Gregory A Engel, Christopher T Small, Khanh Soliven, Mostafa M Feeroz, Xiaoxing Wang, M Kamrul Hasan, Gunwha Oh, SM Rabiul Alam, Karen L Craig, Dana L Jackson, Frederick A Matsen IV, Maxine L Linial och Lisa Jones-Engel För varje apa presenteras en färgstapel som motsvarar apornas provtagningspopulation i (A), och färgade brickor som motsvarar stammar som observerats i den apans blodprov som visas i (B). Icke-kärnstammarna är märkta enligt rekombinanta relationer etablerade med föräldrastammar. Positiva matchningar definieras av minst 90 % sannolikhet för 200 eller fler sammanhängande baspar i en cBrother-analys. Regioner av genomet som inte matchade några föräldrastammar över denna tröskel för minst 200 nt markerades som nks (ingen känd källa). Detta är en förenklad version av en siffra från den kompletterande uppsatsen för denna studie,15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Populationsdynamik hos rhesusmakaker och tillhörande skummande virus i Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013;2:e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] men med uppdaterade stamklassificeringar. Visa full storlekFigur 2 Blodstamklassificeringar för apor från provtagningspopulationer. För varje apa presenteras en färgstapel som motsvarar apornas provtagningspopulation i (A), och färgade brickor som motsvarar stammar som observerats i den apans blodprov som visas i (B). Icke-kärnstammarna är märkta enligt rekombinanta relationer etablerade med föräldrastammar. Positiva matchningar definieras av minst 90 % sannolikhet för 200 eller fler sammanhängande baspar i en cBrother-analys. Regioner av genomet som inte matchade några föräldrastammar över denna tröskel för minst 200 nt markerades som nks (ingen känd källa). Detta är en förenklad version av en siffra från den kompletterande uppsatsen för denna studie,15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al. Populationsdynamik hos rhesusmakaker och tillhörande skummande virus i Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] men med uppdaterade stamklassificeringar.SFV-detekteringWestern blotRhesus macaque fibroblast Telo-RF cell line19Kirchoff V, Wong S, St JS, Pari GS.Generation of a life-expanded rhesus monkey fibroblast cell line for tillväxten av rhesus rhadinovirus (RRV). Arch Virol2002; 147: 321–333. [Crossref], [Google Scholar] smittades av SFV M. mulatta eller M. fascicularis, eller lämnas oinfekterad. Efter 48 timmar lyserades cellerna i 1 × natriumdodecylsulfatprovbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% natriumdodecylsulfat, 5% 2-merkaptoetanol, 0.01% bromfenolblått) och prover el troforiseras genom 10% polyakrylamidgeler. Efter överföring av proteiner till polyvinylidendifluoridmembran (Millipore Billerica, MA, USA), blockerades membranen i fosfatbuffrad saltlösning + 0.05 % Tween-20 innehållande 2 % fettfri torrmjölk och sköljdes med vatten och fick torka. Remsor gjordes, var och en innehållande tre banor (molekylviktsmarkör, oinfekterade Telo-RF och infekterade Telo-RF-celllysat) och primär antikropp (human plasma) tillsattes vid en 1-20 spädning och inkuberades över natten vid 4 ° C. Remsor tvättades tre gånger i fosfatbuffrad saltlösning+0.05% Tween-20 innan tillsats av sekundär get-humant hästrädisperoxidas (Thermo Scientific och GE Healthcare Rochester, NY, USA) vid en spädning på 1 5000 1 timmar i XNUMX timme vid rumstemperatur . Remsor tvättades ytterligare tre gånger innan de sköljdes med vatten och applicerades 3,3 ′, 5,5′-tetrametylbensidinstabiliserat substrat för rädisperoxidas (Promega Madision, WI, USA) för att visualisera band. Plasma från BGH4, en känd SFV-positiv människa20 Jones-Engel L, May CC, Engel GAet al. Emerg Infect Dis2008;14:1200–1208. [Crossref], [Google Scholar] användes som en positiv kontroll. DNA -isolering från helblod Totalt genomiskt DNA extraherades från människans helblod med hjälp av QIAamp DNA -blodminisatsen (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll. Vi extraherade DNA från 200 µL helblod. Det renade DNA:t eluerades i 200 µL buffert AE.PCR-amplifiering av gag- och pol-fragment från genomiskt DNA. Totalt 15 µL av det isolerade DNA:t användes för PCR-amplifiering av gag- eller pol-fragment genom en tvårunda PCR. Första PCR-omgången var en multiplexreaktion med både gag- och pol-primers (primersekvens: G1 (+) (nt 114–134, taget från SFV1 GeneBanksekvens NC_001364 NC_001736) 5′-AGG ATG GTG GGG ACC AGC TA-3 ′; G2 (-) (nt 1451–1433) 5′-CAG GAA GAG GTA CTC GGG G-3 ′; P1 (+) (nt 5179–5200) 5′-GCC ACC CAA GGA AGT TAT GTG G-3 ′; P2 ( -) (nt 5768–5749) 5′-GCT GCC CCT TGG TCA GAG TG) -3 ′. Reaktionerna denaturerades vid 95 °C i 3 minuter, följt av två cykler på 95 °C i 30 s, 38 °C i 1 min, 72 °C i 1 min, sedan följde av 25 cykler med 95 °C i 30 s 52°C i 1 min och 72°C i 1 min. Vatten användes som en negativ kontroll. 2 µL av PCR -produkten användes som mall för den andra omgången PCR. Antingen gag- eller pol-primers (G3 (+) (nt 190–212) 5′-CAA CCT AGA TGG AGA GCT GAA GG-3 ′; G4 (-) (nt 1425–1406) 5′-GGG GAC AAA CTA CGG CTG GG-3 ′; P5 (+) (nt 5339–5361) 5′-TAA TCC TCC AGG GTA TCC AAA A-3 ′; P6 (-) (nt 5728–5707) 5′-ATA CCA TCG ACT ACT ACA AGG A-3 ') användes för att amplifiera enskilda fragment. Reaktionerna denaturerades vid 95 ° C i 3 min, följt av 35 cykler av 95 ° C i 30 s, 52 ° C i 1 min och 72 ° C i 1 min. De förväntade storleken på PCR -produkterna för gag och pol är 1235 bps respektive 390 bps. Kloning och sekvensering av gagfragment FV PCR -produkterna gelrenades med ett QIAquick gel -extraktionskit (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll. De renade fragmenten ligerades in i TOPO-TA-kloningsvektorn (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och transformerades in i Escherichia coli TOP10-kompetenta celler (Invitrogen). Flera enkla kolonier för varje gag-prov selekterades och plasmid-DNA renades och sekvenserades. Sekvensering utfördes med hjälp av M13 framåt och bakåt primers, samt interna fram och bak primers för gag av University of Washington Genomics Facility eller GeneWiz Inc. (Seattle, WA, USA). Virala stammar betecknas med små bokstäver för att skilja dem från de geografiska platser där människorna eller makakerna togs (t.ex. Dhamrai är en studieplats där dhamrai -kärnstammen detekterades.) Isolering av RNA från buckala pinnar Frysta munstycksprover i RLT -buffert (Qiagen) tinades vid 37 ° C i 15 minuter med 40 U av RNaseOUT-ribonukleashämmaren (Invitrogen) och 1 U RNasfritt DNas I (Promega) omedelbart före RNA-extraktion. Totalt RNA extraherades enligt standardprotokollet med RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA behandlades igen med 40 U RNaseOUT och 1 U RNase-fritt DNas I vid 37 ° C under 1 timme. Prover inkuberades sedan vid 65 °C i 15 minuter för att inaktivera enzymer. RNA lagrades vid -20 ° C för efterföljande användning. Omvänd transkription-PCR (RT-PCR) av munstyckspinne RNART-PCR utfördes för att klona partiella gag-sekvenser (1235 bp) från buccal swab RNA. Första-strängs cDNA syntetiserades med användning av Thermoscript RT-PCR-systemet (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll med användning av en Oligo(dT)18-primer. RT -reaktionerna inaktiverades vid 85 ° C i 5 minuter. De resulterande cDNA användes som mall för två runda PCR som beskrivits ovan för fullblod FV gag amplifiering. Analys Klusteringsmetoder och hypermutationsanalys Sekvenser som undersöks i denna studie uppvisade bevis på APOBEC3-medierad hypermutation. En grundlig analys av denna verksamhet presenteras i Matsen et al. (opublicerad). Denna analys producerade förmodligen hypermutation negativa sekvensjusteringar genom att ta bort kolumner som misstänks för hypermutation. Dessa justeringar användes för resten av analyserna i denna studie, för att undvika sammanblandning av hypermutation och äkta fylogenetisk signal. Filogenetiska analyser Ett fylogenetiskt träd konstruerades från den förmodligen hypermutationsfria anpassningen med FastTree 2.1.7.21 Pris MN.DPAAP FastTree: beräkna stora minsta utvecklingsträd med profiler istället för en avståndsmatris. Mol Biol Evol2009;26:1641–1650. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar],22Price MN, Dehal PS, Arkin AP.FastTree 2—ungefär maximala sannolikhetsträd för stora linjer. PLoS ONE2010;5:e9490. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] Det här trädet visualiserades med Archeopteryx (https://sites.google.com/site/cmzmasek/home/software/archaeopteryx). Från samma inriktning, SplitsTree 4.12.823Huson DH, Bryant D.Tillämpning av fylogenetiska nätverk i evolutionära studier. Mol Biol Evol2006; 23: 254–267. ] Det visade sig att en enda applikation av UCLUST v1.124Edgar RC. Sök och klustera storleksordningar snabbare än BLAST. Bioinformatik2010;26:2460–2461. [Crossref], [Web of Science ®], [Google Scholar] gav dåliga klustringsresultat på grund av algoritmens giriga natur. En iterativ algoritm för recentering, föreslagen av UCLUST -författaren på http://drive5.com/usearch/manual/recenter.html, implementerades som hanterade problemet bra. För varje omgång av klustering lades konsensussekvenser från föregående omgång till toppen av en ofördelad inriktning, i ordning efter klusterstorlek från störst till minst. För denna iteration utfördes klustering med hjälp av cluster_smallmem och producerade nya konsensussekvenser och kluster. Denna process upprepades två gånger. Klustertilldelningar finjusterades ytterligare av ett skript som hittade den sanna tyngdpunkten för varje kluster, som definieras av sekvensen med minimalt genomsnittligt normaliserat Hamming-avstånd till varannan sekvens i klustret. Skriptet kontrollerades sedan för att säkerställa att varje sekvens klustrade med tyngdpunkten som den var närmast (återigen, enligt definitionen av normaliserat Hamming-avstånd), vilket gjorde omtilldelningar vid behov. Denna iterativa algoritm tillämpades med ett tröskelvärde på 97.77 %. Denna tröskel, medan den är något högre än den som används i vår följeslagare, 15Feeroz MM, Soliven K, Small CTet al.Population dynamics of rhesus macaques and associated foamy virus in Bangladesh. Emerg Microbes Infect2013; 2: e29. [Taylor & Francis Online], [Google Scholar] återspeglar bättre den något lägre mängden sekvensdiversitet som ett resultat av borttagning av kolumner som misstänks för hypermutation. Som nämnts ovan betecknas virusstammar med små bokstäver för att skilja dem från de geografiska platser där människor eller makaker togs (t.ex. Dhamrai är en studieplats där dhamrai -kärnstammen huvudsakligen hittades.) Statistiska metoder Statistisk analys av demografiska variabler var utförd med hjälp av JMP (SAS Institute, Cary, NC, USA) statistikprogrampaket; analys av beredskapstabeller utfördes med funktionen R fisher.test.25 R Core Team. R: Ett språk och miljö för statistisk beräkning. Wien: R Foundation for Statistical Computing, 2012. [Google Scholar] RESULTAT Demografiska data inklusive NHP-exponeringar Under en femårsperiod, 5–2007, samlades biologiska prover från 2011 personer.

Lämna ett meddelande 

meddelande~~POS=TRUNC